اندازه گیری مقادیر اندک نیتریت به روش تجزیه تزریق جریانی معکوس با استفاده از واکنشگر طبیعی زعفران

اندازه گیری مقادیر اندک نیتریت به روش تجزیه تزریق جریانی معکوس با استفاده از واکنشگر طبیعی زعفران

سیاوش نوروزی^*، معصومه آقامحمدی

زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده علوم، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 17/04/96              تاریخ تصحیح:16/10/96           تاریخ پذیرش: 14/10/97

چکیده

اندازه‌گیری و ردیابی مقادیر اندک آنیون نیتریت به عنوان یک گونه‌ی شیمیایی پراهمیت از نظر محیط زیست، ایمنی و سلامت و نیز از لحاظ صنایع گوناگون به ویژه صنایع غذایی به خاطر تنوع کاربردنمک های  نیتریت در این صنایع و هم به عنوان پیش‌ماده در تولید و تشکیل ترکیبات نیتروزآمین سرطان‌زا از اهمیت فراوانی برخوردار است. در کار حاضر که در حیطه شیمی سبز قرار دارد، روش تجزیه‌ای مبتنی بر سامانه ی تجزیه ای تزریق جریانی جهت اندازه‌گیری‌های ارزان، سریع، ایمن و با تکرارپذیری بالا جهت تعیین کمی آنیون نیتریت ارائه شده است. بعلاوه استفاده از تکنیک تزریق جریانی معکوس(rFIA) همچنین، باعث کاهش مصرف واکنش‌گرها شده و لذا کاهش هزینه تجزیه‌های شیمیایی و نیز آلودگی حداقلی محیط زیست را همراه داشته است. اساس شیمیایی روش تجزیه‌ای پیشنهادی بر واکنش رنگدانه طبیعی زعفران با آنیون نیتریت استوار است. محلول رنگدانه زعفران در محیط اسیدی با آنیون نیتریت واکنش می‌دهد و میزان کاهش جذب آن در طول‌موج 440 نانومتر به عنوان علامت تجزیه‌ای ثبت می‌گردد. متغیرهای دستگاهی و شیمیایی تاثیرگذار بر روی علامت تجزیه‌ای مورد بررسی و مطالعه قرار گرفته و بهینه‌سازی شده‌اند. در شرایط بهینه شده، محدوده‌ی خطی پویا در فاصله‌های غلظتی 3 الی 15 نانو‌گرم بر میلی‌لیتر با حساسیت 40/1 و 30 الی 180 نانوگرم بر میلی‌لیتر با حساسیت 36/0 حاصل شده است. بر اساس نسبت علامت به نوفه برابر 3، حد تشخیص روش برابر 5/2 نانوگرم بر میلی‌لیتر و انحراف معیار نسبی در اندازه‌گیری تکراری نیتریت با غلظت 100 نانوگرم بر میلی‌لیتر برابر 8/1 درصد به دست آمده است. سرعت تجزیه در شرایط بهینه برابر 130 تجزیه در هر ساعت قابل دست‌یابی است.

کلمات کلیدی: سامانه تزریق جریانی معکوس، نیتریت، زعفران.

1-مقدمه

آنیون نیتریت عموماً در شکل نمک سدیم نیتریت به عنوان نگه‌دارنده و جلوگیری کننده از رشد میکروب‌ها و تثبیت رنگ در فرآورده های گوشتی، ماهی و مرغ استفاده می‌شود. همچنین به مقادیر اندک در سبزیجات، آب آشامیدنی یافت می‌شود. نیتریت از طریق آب، هوا و موادغذایی وارد بدن انسان می‌شود.

اندازه‌گیری آنیون نیتریت به چند دلیل ضروری است اول آنکه می‌تواند هموگلوبین خون را اکسید کرده و به متهموگلوبین[1] تبدیل کند که این ماده عمل اکسیژن‌رسانی به بدن را مختل می‌کند و دوم اینکه نیتریت با بعضی از آمین‌ها و آمیدها در بدن آمیخته و باعث پیدایش نیتروزآمین که ماده‌ای سرطان‌زاست، می‌شود. لذا استفاده بیش از حد غلظت مجاز نیتریت به عنوان نگه‌دارنده در صنایع مواد غذایی ممنوع بوده و همچنین حضور آنیون نیتریت در آب آشامیدنی با توجه به سمیت آن مجاز نیست]3-1[. به همین جهت در بسیاری از نقاط جهان، موضوع آلودگی منابع آب‌های مصرفی به نیتریت مشکلی جدی به شمار می‌آید. روز به روز با توسعه فعالیت‌های کشاورزی، استفاده از کودهای شیمیایی حاوی نیترات رونق بیش‌تری پیدا می‌کند. نیترات موجود بر اثر احیاء تبدیل به نیتریت می‌شود. این موضوع نهایتا موجب افزایش آنیون نیتریت در آب‌های مصرفی می‌شود. این معضل در ایران و به ویژه در شهرهای شمالی کشور بیشتر است و متاسفانه سبب شیوع سرطان در این منطقه گردیده است. مطالعات کیفیت آب در برخی از شهرهای کشورمان نشان داده است که غلظت نیتریت در آب بعضی از چاه‌ها بیش از حد استاندارد بوده است، به طوری که این چاه‌ها از مدار بهره‌برداری برای مصارف شرب خارج گشته است. از سویی در شهرهای صنعتی، فاضلاب برخی کارخانه‌ها، مقادیر قابل توجهی نیتریت وارد آب‌های سطحی می‌کنند. با در نظر گرفتن موارد اشاره شده، حذف نیتریت از آب‌های سطحی و زیرسطحی از نیازهای اساسی در پالایش آب می‌باشد. در همین راستا ارائه ی روش های جدید برای اندازه‌گیری و ردیابی محتوای نیتریت منابع آب همیشه مورد توجه بوده است و به ویژه روش‌هایی که علاوه بر داشتن حساسیت بالا، ساده، ارزان و سریع بودن، بر اساس اصول شیمی سبز، آلودگی کمتری نیز داشته باشند، از اهمیت زیادی برخوردار است]4[. گروه‌های تحقیقاتی بسیاری در پی یافتن راه‌های جدید، ساده، سریع و حساس برای اندازه‌گیری آنیون‌ نیتریت هستند. بسیاری از روش‌های توسعه یافته در چند سال اخیر برای تعیین نیتریت عموما شامل روش‌های طیف‌سنجی نوری، فلوئورسانس‌سنجی، کروماتوگرافی و انواع روش‌های تزریق جریانی بوده است[11-5]. روش‌های تجزیه ی تزریق جریانی، روش‌هایی کامل و با سرعت بالا می‌باشند که تمام خصوصیت های اشاره شده را می تواند ارائه نماید. برخی از این روش‌ها انتخاب‌پذیر و دارای حساسیت خوبی هستند اما نیاز به مصرف واکنشگرهای گرانقیمت و اغلب دارای اثرهای مخرب زیست محیطی می‌باشند. در روش پیشنهادی حاضر، اندازه‌گیری کمّی آنیون نیتریت در مقادیر اندک با روش تزریق جریانی معکوس انجام شده است که مزایایی ازجمله سرعت تجزیه بسیار بالا، کاهش قابل توجه در حجم واکنشگرهای مصرفی، استفاده از واکنشگر طبیعی و نیز استفاده از نورسنجی ساده را در بر دارد که منجر به ارائه روشی کاملاً سبز و منطبق بر مسائل زیست محیطی شده است.

2-بخش تجربی

2-1-مواد شیمیایی و معرف‌های مورد استفاده

تمام مواد شیمیایی مورد استفاده در این پروژه از مواد شیمیایی با خلوص تجزیه‌ای و محصول شرکت‌ مرک بودند. در تمام مراحل تهیه محلول‌ها از آب یک بار تقطیر استفاده شده است. برای هریک از مواد، محلول‌ مادر (اصلی) تهیه شد و محلول‌های مورد نیاز از رقیق کردن محلول‌ اصلی به دست آمد. محلول اصلی زعفران به غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از انحلال 01/0 گرم پودر زعفران (قائنات) که قبلاً به مدت 4 ساعت در دمای 85 درجه سانتی‌گراد خشک شده بود، در بالن حجمی 100 میلی‌لیتری و سپس به حجم رساندن با آب مقطر، تهیه شد. محلول تهیه شده پایدار بوده و محلول‌های مصرفی با رقیق کردن این محلول‌، به طور روزانه تهیه می‌شدند. محلول اصلی نیتریت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از انحلال 015/0 گرم نمک سدیم نیتریت (مرک) خشک شده به مدت نیم ساعت در دمای 80 درجه سانتی‌گراد در بالن حجمی 100 میلی‌لیتری و به حجم رساندن با آب مقطر تهیه شد. محلول های هیدروکلریک اسید با غلظت مورد نظر از رقیق کردن محلول غلیظ هیدروکلریک اسید (مرک با خلوص 37 درصد) در بالن 100 میلی‌لیتری تهیه می شدند.

2-2- دستگاه‌های مورد استفاده

جهت انتقال محلول ها در درون لوله‌ها، از پمپ پریستالتیک هشت کاناله BECKMAN با قابلیت کنترل سرعت استفاده شده است. از طیف نورسنج Shimadzu مدلUV-160 به عنوان آشکارساز علامت تجزیه ای استفاده شده است. لوله‌های مورد استفاده برای پمپ کردن محلول‌ها از جنس سیلیکونی با قطر داخلی 8/0 میلی‌متر و برای مارپیچ واکنش، لوله‌ از جنس تفلونی به قطر داخلی 5/0 میلی‌متر استفاده شد. جهت اتصال لوله ها از اتصال دهنده T شکل شیشه‌ای با قطر متناسب لوله‌ها استفاده شد. حلقه[2] نگه‌دارنده نمونه برای تزریق و لوله‌های رابط از جنس تفلونی با قطر داخلی 5/0 میلی‌متر استفاده شد و تزریق نمونه‌ها توسط شیر تزریق شش راهه[3] Vici مدل C22z-3186 انجام گرفت. سل جریانی 0/20 میکرولیتری ساخت شرکت Starna برای اندازه‌گیری‌های جذب محلول‌ها در سامانه تزریق جریانی متصل شده به طیف نور سنج استفاده شد.

2-3- طیف جذبی زعفران

طیف جذبی محلول اسیدی زعفران در ناحیة مرئی و فرابنفش و تغییرات ناشی از افزودن محلول محتوی آنیون نیتریت در شکل 1 آمده است. کاهش جذب در طول موج بیشینه ی 440 نانومتر با حضور نیتریت و واکنش آن با رنگدانه ی زعفران که متناسب با غلظت نیتریت می باشد، به عنوان علامت تجزیه ای در اندازه گیری نورسنجی محلول های حاوی نیتریت در سامانه ی جریانی استفاده شده است.

شکل 1: کاهش در طول موج بیشینه جذب (440 نانومتر) طیف جذبی محلول زعفران با افزودن محلول حاوی آنیون نیتریت. شرایط: زعفران 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر، هیدروکلریک اسید 2/1 مولار، نیتریت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر.

2-4- طراحی سامانه تزریق جریانی معکوس

یکی از روش‌های اجرایی سامانه‌های تجزیه‌ای تزریق جریانی، روش تزریق جریانی معکوس(rFIA) است که طی آن به جای تزریق نمونه، واکنشگر(ها) از طریق شیر تزریق به جریان سیال حاوی نمونه تزریق می شود. از مزایای این شکل اجرا می توان به کاهش در مصرف واکنشگر(ها) و لذا تولید حداقل پساب واکنشی، کاهش هزینه های تجزیه، افزایش سرعت تجزیه و حساسیت، اشاره نمود. کاهش در تولید پساب به ویژه از نظر محیط زیست دارای اهمیت است و بر این اساس این دسته از روش ها را می توان در زمره ی روش های تجزیه ای سبز طبقه بندی نمود. این روش اجرا همچنین در مواقعی که محدودیت در مقدار نمونه های تجزیه ای وجود ندارد، مثل تجزیه ی محتوای گونه های موجود در آب دریا، بسیار مورد توجه می باشد. برای اندازه‌گیری یون نیتریت به روش تجزیه تزریق جریانی معکوس سامانه تجزیه ای نشان داده شده در شکل 2 طراحی و اجرا شد. سامانه از یک دستگاه پمپ پریستالتیک، شیرتزریق شش راهه حاوی لوله‌ی تفلونی به حجم 100 میکرولیتر برای واکنشگر تزریقی، واکنشگاه به طول 50 سانتی‌متر (لوله تفلونی برای اختلاط نمونه و واکنشگر) و آشکارساز نورسنج جذبی ناحیه مرئی برای ثبت داده‌ها و علامت تجزیه‌ای ، تشکیل شده است. عوامل موثر بر علامت تجزیه‌ای به روش یکی در یک زمان بهینه‌سازی شدند و در شرایط بهینه حاصل، غلظت آنالیت در محیط‌های شیمیایی مختلف و نمونه های حقیقی اندازه‌گیری شده است.

شکل2: سامانه تجزیه‌ای تزریق جریانی معکوس که برای اندازه‌گیری نیتریت طراحی شده است.

3-بحث و نتیجه‌گیری

3-1- مطالعه ی متغیرهای اثرگذار بر حساسیت تجزیه ای

به منظور حصول بهترین شرایط برای ثبت علامت تجزیه ای، تاثیر عوامل مختلف شیمیایی و دستگاهی بر عملکرد سامانه ی تجزیه ای پیشنهاد شده مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. تمام متغییر های شیمیایی شامل غلظت واکنشگر طبیعی زعفران، میزان اسیدیته، و متغیرهای دستگاهی شامل سرعت جریان محلول ها، طول واکنشگاه و حجم نمونه ی تزریقی در این مطالعه بررسی شدند.

3-2- اثر غلظت رنگ زعفران

غلظت محلول رنگدانه زعفران از متغیرهای اصلی بر میزان علامت تجزیه ای است. در شرایط غلظت هیدروکلریک اسید 2/1 مولار، آنیون نیتریت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر، سرعت جریان محلول 3 میلی‌لیتر بر دقیقه، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر و حجم تزریق 100 میکرولیتر، اثر غلظت زعفران در محدوده‌ی غلظتی 20 تا 120میکروگرم بر میلی‌لیتر بر علامت تجزیه ای (ارتفاع پیک نمودار تزریق جریانی[4]) مورد بررسی قرار گرفت. بر طبق نتایجی که در شکل 3 آمده است افزایش غلظت زعفران تا 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر منجر به افزایش تندی در علامت تجزیه‌ای می‌گردد و پس از آن شیب افزایش کم بوده و نیز میزان نوفه بالائی در خط پایه ناشی از جذب رنگدانه به دیواره سل جریانی ایجاد می شود. برای داشتن نسبت علامت به نوفه مناسب مقدار بهینه 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای غلظت محلول زعفران انتخاب شد.

شکل 3: مطالعه ی تاثیر غلظت زعفران بر علامت تجزیه ای. شرایط: هیدروکلریک اسید 2/1 مولار، نیتریت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر، ، سرعت جریان محلول 3 میلی‌لیتر بر دقیقه، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر، حجم تزریق 100میکرولیتر.

3-3- اثر غلظت هیدروکلریک اسید

واکنش کمّی آنیون نیتریت با رنگدانه زعفران در محیط اسیدی انجام می شود. میزان اسیدیته به عنوان متغیر مهم به منظور دست‌یابی به علامت تجزیه‌ای بهینه با مطالعه ی اثر غلظت هیدروکلریک اسید در گستره‌ی غلظتی 0 تا 5/2 مولار انجام شد. در شرایط بهینه شده غلظت محلول زعفران 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر و علظت آنیون نیتریت 1 میکروگرم‌ بر میلی‌لیتر، سرعت جریان محلول 3 میلی‌لیتر بر دقیقه، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر، حجم تزریق 100میکرولیتر، افزایش غلظت هیدروکلریک اسید میزان علامت تجزیه ای را افزایش می‌دهد( شکل 4) ولی در غلظت‌های بالاتر نوفه خط پایه زیاد شده و نیز پایداری علامت تجزیه ای کم می‌شود. بنابراین غلظت 2 مولار به عنوان غلظت بهینه اسید انتخاب شد.  

شکل 4: اثر اسیدیته محلول بر علامت تجزیه ای. شرایط: زعفران ۱۰۰ میکروگرم بر میلی‌لیتر، نیتریت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر، سرعت جریان محلول 3 میلی‌لیتر بر دقیقه، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر، حجم تزریق 100 میکرولیتر.

3-4- اثر سرعت جریان

سرعت جریان محلول(ها) در سامانه های تزریق جریانی به جهت تاثیر بر میزان پراکندگی نمونه تزریق شده درون سیال و نیز مقدار درهم آمیختگی اهمیت دارد که این موضوع در نهایت بر میزان کامل شدن واکنش اثر دارد، لذا به دست آوردن شرایط بهینه برای سرعت جریان محلول(ها) در این سامانه ها اهمیت دارد. در شرایط غلظتی بهینه شده از هیدروکلریک اسید (2 مولار)، زعفران(100 میکروگرم‌ بر میلی‌لیتر) و غلظت آنیون نیتریت 1 میکروگرم‌ بر میلی‌لیتر، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر، حجم تزریق 100 میکرولیتر، سرعت جریان‌های مختلف در گستره 2/2 تا 3/3 میلی‌لیتر بر دقیقه مورد بررسی قرار گرفت. طبق نتایجی که در شکل 5 آمده است. سرعت جریان بهینه برابر 3 میلی‌لیتر بر دقیقه حاصل شده است. در سرعت‌های بالا توزیع تودة نمونه کم است و تودة تزریقی فرصت زمان کمی برای واکنش در اختیار دارد و واکنش کامل نمی‌شود لذا حساسیت کم می‌شود در سرعت‌های خیلی پایین میزان توزیع نمونه زیاد شده و واکنش به طور کامل انجام می‌گیرد ولی پهنای پیک‌ها زیاد شده و باعث طولانی شدن زمان تجزیه می‌شود. بنابراین برای داشتن حساسیت بالا و سرعت تجزیة مناسب، سرعت جریان محلول برابر 3 میلی‌لیتر بر دقیقه به عنوان سرعت بهینه انتخاب گردید.

شکل 5: بررسی اثر سرعت جریان محلول. شرایط: زعفران ۱۰۰ میکروگرم بر میلی‌لیتر، هیدروکلریک اسید ۲ مولار، نیتریت ۱ میکروگرم بر میلی‌لیتر طول واکنشگاه ۵۰ سانتی‌متر، حجم نمونه تزریق ۱۰۰ میکرولیتر.

3-5- اثر طول لولة واکنشگاه

تاثیر طول لوله واکنشگاه بر روی علامت تجزیه ای سامانه تزریق جریانی در شرایط بهینه شده غلظت واکنشگرها، هیدروکلریک اسید 2 مولار، زعفران 100 میکروگرم ‌بر میلی‌لیتر و بهینه سرعت جریان محلول3 میلی‌لیتر بر دقیقه، نیتریت 1 میکروگرم‌ بر میلی‌لیتر، حجم تزریق 100 میکرولیتر، در محدوده‌ی 0/50 تا 0/150 سانتی‌متر مورد بررسی قرار گرفت( شکل 6). در طول بیش‌تر از 50 سانتی‌متر پیک‌ها پهن‌تر و زمان تجزیه طولانی‌تر می‌شود و تعداد تجزیه ها در واحد زمان کاهش می‌یابند. برای داشتن علامت تجزیه ای مناسب و مدت زمان تجزیه ای کوتاه، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر به عنوان طول بهینه انجام واکنش انتخاب گردید.

شکل 6:  بررسی اثر طوللوله ی واکنشگاه. شرایط: زعفران 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر، هیدروکلریک اسید 2 مولار، نیتریت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر، سرعت جریان 3 میلی‌لیتر بر دقیقه، حجم تزریق نمونه 100 میکرولیتر.

3-6- اثر حجم نمونه تزریقی

در شرایط بهینه شده از غلظت هیدروکلریک اسید(2 مولار)، زعفران(100 میکروگرم‌ بر میلی‌لیتر)، سرعت جریان محلول 3 میلی‌لیتر بر دقیقه و طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر و نیز غلظت آنیون نیتریت 1 میکروگرم‌ بر میلی‌لیتر، اثر حجم نمونه تزریقی بر ارتفاع پیک در گستره 0/50 تا 0/150 میکرولیتر مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه در شکل 7 آمده است. با افزایش حجم نمونه تزریقی حساسیت افزایش می‌یابد ولی در حجم‌های خیلی بالا پیک‌ها به خاطر گستردگی بیشتر تودة نمونة تزریق شده پهن‌تر می‌شوند که باعث طولانی شدن زمان تجزیه می‌شود. در نتیجه برای رسیدن به بهترین شرایط به ویژه از نظر زمان تجزیه، حجم 100 میکرولیتر به عنوان بهینه حجم واکنشگر تزریقی در سامانه تزریق جریانی معکوس انتخاب شد.

شکل 7: بررسی اثر حجم واکنشگر تزریقی شرایط: زعفران 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر، هیدروکلریک اسید 2 مولار، نیتریت 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر سرعت جریان 3 میلی‌لیتر بر دقیقه، طول واکنشگاه 50 سانتی‌متر.

جدول 1 نتایج بهینه حاصل از مطالعه ی اثر عوامل شیمیایی و دستگاهی بر روی علامت تجزیه‌ ای را نشان می دهد.

جدول 1- سطوح بهینه شده عوامل فیزیکی و شیمیایی موثر بر روی علامت تجزیه‌ای

3-7-ارقام شایستگی

برای تسهیل در اعتبار بخشی و ارزیابی روش های تجزیه ای لازم است ارقام شایستگی برای روش تجزیه ای پیشنهاد شده گزارش گردد. به این منظور لازم است در شرایط بهینه شده ی شیمیایی و دستگاهی، منحنی درجه‌بندی برای حصول ناحیه‌ی غلظتی خطی پویا و حساسیت، انحراف معیار نسبی برای بیان میزان دقت روش و مقدار حداقل غلظت قابل اندازه‌گیری برای بیان حد تشخیص سامانه تجزیه‌ای پیشنهادی، مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس داده‌های حاصل از رسم منحنی درجه بندی، محدوده‌ی خطی پویا در فاصله‌های غلظتی 0/3 الی 0/15 نانوگرم بر میلی‌لیتر از آنیون نیتریت با حساسیت 40/1 و 0/30 الی 180 نانوگرم بر میلی‌لیتر از آنیون نیتریت با حساسیت 36/0 حاصل شده است. معادله خط برگشت برای این دو ناحیه غلظتی همراه با ضریب همبستگی مربوطه در شکل 8 (الف و ب) نشان داده شده است.

الف

ب